产品目录

本制品是一种即用型的无缝克隆产品，包含感受态细胞在内的全套试剂盒，更加便利于用户进行无缝克隆。无缝克隆是一种新型、快速、简洁的克隆方法，可以同时将1~4个DNA片段克隆到任何载体中。反应时间短至20分钟，阳性率达到95%以上。只需插入的DNA片段末端与载体末端具有15～25个同源碱基序列就可以在载体的任意位点完成克隆重组。

• 载体线性化
  采用酶切或PCR扩增方法将载体线性化。
  
  • 酶切法：
    
    • 载体酶切一定要完全，否则未切开的载体会影响后续的阳性克隆鉴定。
      
    • 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可。但为了提高阳性率，我们建议您采取双酶切方法获得线性化载体。
      
    • 酶切获得的载体可以是3'突出或5'突出，也可以是平末端线性化载体。但3'突出或平末端的线性化载体可以提高克隆的效率。
      
    • 酶切获得的线性化载体需进行纯化后使用。
  • PCR扩增法：
    
    • 选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18～20bp左右，一般载体长度均大于3kb，建议用高保真的聚合酶扩增。
      
    • 为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议载体酶切后再用PCR扩增，自连背景更低，阳性率更高。
• 目的DNA片段的PCR扩增
  扩增目的DNA片段的引物5'末端要附加与载体末端相同的碱基序列(15～25bp)，因此PCR每条引物长度至少在35～40bp，包括5'端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列20～25bp。
  
  • 如果是表达载体克隆构建，引物设计完全后，请注意检查读码框的正确。
  • 引物设计：
    引物设计是很重要的，在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则，只不过上下游引物要加上15～25bp的载体同源序列。
    引物序列包括是：5'-15～25bp同源序列-所需酶切位点序列-特异性引物序列-3'。
    
  • 载体酶切：
    载体酶切后有5'端突出、3'端突出或平末端三种情况。载体同源序列如何添加主要分以下三种情况：
    
    • 载体切开后为平末端
      
      
      
      
    • 载体切开后5'端突出，突出序列不计算在同源序列的15bp之内
      
      
      
      
    • 载体切开后3'端突出，突出序列计算在同源序列的15bp之内
      
      
    • 15bp同源序列不要求严格从载体最末一个碱基计算，但载体末端非同源序列过长会降低重组效率。建议末端非同源序列不超过30bp。
• 目的片段与载体的重组
  将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到PCR管中进行重组反应。以20μL反应体系为例。
  

  成分	用量
  2×Seamless Cloning Mix	10μL
  线性化载体	50～100ng
  插入片段	x ng
  无菌ddH2O	至20μL
  50℃反应20分钟。反应结束后，立即将离心管置于冰上冷却2分钟，待转化。

  • 目的片段与载体的摩尔比建议2:1~3:1之间。当插入片段总和> 5kb的时候，可适当延长孵育时间到30～50分钟。
• 转化
  
  • 加入4μL的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育30分钟。
    
  • 42℃水浴中热激45秒后快速放入冰上2分钟。
    
  • 加入500μL SOC或LB液体培养基，37℃孵育60分钟。
    
  • 5000rpm离心2分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。
    
  • 37℃培养箱中倒置培养12～16小时。
    
  • 用牙签挑取白色菌落，以载体通用引物或基因特异性引物进行PCR扩增。